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科学家用来筛药的斑马鱼竟然只有米粒那么大!这个“小精灵”有什么厉害之处?

发布时间:2019-08-02
文章出处:APExBIO 微信公众号 实验室的96孔板通常是用来培养细胞的,来自美国华盛顿大学西雅图分校的研究团队竟然用来“养鱼”——用96孔板来孵育斑马鱼(zebrafish)!一条新孵出的斑马鱼,比一粒米还小,从图1所示,每个孔中的斑马鱼在欢快地游着。图1 96孔板的每个孔…

文章出处:APExBIO 微信公众号


       实验室的96孔板通常是用来培养细胞的,来自美国华盛顿大学西雅图分校的研究团队竟然用来“养鱼”——用96孔板来孵育斑马鱼(zebrafish)!一条新孵出的斑马鱼,比一粒米还小,从图1所示,每个孔中的斑马鱼在欢快地游着。


图1 96孔板的每个孔中是只有5天大小的斑马鱼。96孔板的孔径约0.64 cm。这些小鱼是治疗听力障碍的关键(它们体表的毛细胞是哺乳动物听觉和内耳毛细胞的最佳模型)。图片由华盛顿大学西雅图分校的Edwin Rubel提供。

 

        斑马鱼的体表(从头部到尾部)都长有称为神经丘(neuromasts)的毛细胞团。斑马鱼体表的毛细胞能够发挥与人类耳蜗内的毛细胞类似的作用。斑马鱼的毛细胞是用来探测水中的振动,哺乳动物的毛细胞是听觉的感受器,与内耳中耳蜗的神经相连。与人类不同的是,斑马鱼的毛细胞在受损后还可以再生,而人类的毛细胞不会再生,一旦足够多的毛细胞死亡或突变,听觉便开始衰退。斑马鱼的毛细胞对作用于哺乳动物内耳毛细胞的药物同样敏感。研究人员希望这些小小的斑马鱼和毛细胞可以用于治疗一些药物毒副作用带来的耳聋。

 

       2005年以来,华盛顿大学和弗雷德•哈钦森癌症研究中心的三个实验室一直在利用斑马鱼分析并鉴定能够保护听觉细胞免受毒副作用的药物,这些毒副作用来源于耳毒性的抗生素(氨基糖苷类抗生素)和肿瘤化疗化合物。华盛顿大学神经发育遗传学家David Raible对斑马鱼颇有研究,他发现了一种染料(dye),被活的神经丘吸收后,在荧光显微镜下观察发现它们可以发光,而那些被抗生素杀死的毛细胞不发光。通过对每个神经丘中发光的毛细胞进行评析,研究人员可以快速鉴定生物活性化合物或表型改变的突变。

 

图2 年龄只有5天的转基因斑马鱼(brn3c:gfp)。绿色亮点是神经丘。右下角是神经丘的放大图。Esterberg R, et al. (2013)

 

       研究者们发现斑马鱼毛细胞对抗生素的浓度非常敏感。通过改变添加到孔中的抗生素的量,抗生素可以持续杀死每个神经丘中的全部,一些或仅几个细胞。这种一致性表明斑马鱼实验将足以作为表型药物发现的工具。

 

       2005年至2006年间,研究人员利用小分子化合物库测试了11,000种化合物,并发现了一类非常有效的可以阻断氨基糖苷类抗生素造成的耳毒性的分子——benzothiophene carboxamides(苯并噻吩甲酰胺),如PROTO-1和PROTO-2(Owens KN, et al. 2008)。然而,他们很快发现了一个问题,PROTO-1对人体有副作用,PROTO-1 抑制hERG钾离子通道蛋白,其对心肌细胞的功能至关重要。另一个问题是PROTO-1的半衰期和溶解度低,不可能将它包裹成小药丸存放。

 

        研究人员又想到了斑马鱼,可以用它来测试PROTO-1的变体。最近,该研究小组利用斑马鱼对化合物进行了400多种化学修饰,欲将其优化为更有效的药物(Chowdhury S, et al.  2018)。该研究团队发现了一种更稳定的化合物,其抑制耳毒性效应的效力比PROTO-1强近百倍,对hERG途径的抑制作用非常微弱。这种新化合物见图3,FDA在今年早些时候批准它作为一种新的药物。他们计划在今年进行一期临床试验。另外,该团队一直在利用斑马鱼揭示耳毒性药物杀死神经丘毛细胞的基因和机制。


 图3 对筛选的药物PROTO-1进行化学修饰

 

为什么人们要用斑马鱼进行科学研究?

       近十年来对斑马鱼的广泛研究揭示了人类心血管、神经和其他生物过程中涉及的基因、细胞机制和药物。斑马鱼是一个活的有机体,具有复杂的器官和生理系统。盐湖城犹他大学化学生物学教授Randall Peterson是使用斑马鱼来筛选小分子的第一人,他说,利用斑马鱼可以用较少量的化合物进行大规模的筛选。鱼可以直接从水中吸收化学物质,它们的透明度意味着不需要解剖。在哺乳动物中进行等效研究的成本肯定会更加高。

 

       斑马鱼的神经丘在一小时内就可对施用药物做出反应,而且允许研究人员可以有几个月的时间完成筛查。虽然哺乳动物的内耳毛细胞用于听觉,斑马鱼的神经丘纯粹是为了感知周围水中的波动。但在细胞水平上,神经丘毛细胞和哺乳动物内耳毛细胞的功能类似。两种细胞类型都具有外部附属物,这些附属物对它们周围的流体的运动作出响应,并且通过电信号将信息传递给大脑。从20世纪80年代后期开始的遗传学筛选揭示了这两种细胞类型之间高度保守的基因(Nicolson T, et al. 1998)。斑马鱼和人类基因有着87%的高度同源性,作为模式生物的优势很突出。

 

       神经科学家Edwin Rubel说,几乎所有脊椎动物的毛细胞,除了哺乳动物,都很容易再生。没有人知道为什么哺乳动物失去了这种能力。但是如果没有这种再生能力,老化、噪音损害和耳毒性化学物质都会导致永久性听力丧失和耳聋。这些耳毒性化学物质其实也是救命药物,如抗癌药物顺铂或强效广谱氨基糖苷类抗生素,医生及患者必须平衡听力损失风险与药物有效性之间的关系。“目前,市场上没有可靠的药物来防止任何形式的听力损失,”Rubel说。氨基糖苷类破坏细菌核糖体蛋白质合成,通过一种人们还不了解的机制靶向内耳细胞,而且具有个体差异。而最近利用斑马鱼发现的一种新化合物有望解决这个难题。

 

       当利用斑马鱼进行表型筛选鉴定出具有丰富生物学特性的生物活性化合物时,是非常有益的。为了防止甚至逆转听力损失,需要确定关键的途径和基因,而斑马鱼能为他们指出正确的方向。

 

文章来源:

1. Inner Workings: Zebrafish assay forges new approach to drug discovery.

Kim Smuga-Otto.

PNAS May 22, 2018.

2. Owens KN, et al. (2008) Identification of genetic and chemical modulators of zebrafish mechanosensory hair cell death. PLoS Genet 4:e1000020.

3. Chowdhury S, et al. (2018) Phenotypic optimization of urea-thiophene carboxamides to yield potent, well tolerated, and orally active protective agents against aminoglycoside-induced hearing loss. J Med Chem 61:84–97.

4. Nicolson T, et al. (1998) Genetic analysis of vertebrate sensory hair cell mechanosensation: The zebrafish circler mutants. Neuron 20:271–283.

5. Esterberg R, et al. (2013) Fish in a dish: Drug discovery for hearing habilitation. Drug Discov Today: Dis Models 10:e23–e29.