它是发育生物学家的得力助手,是医学研究的后起之秀,是环境监测的哨兵,是指示兵,是药物研发的新宠,它就是脊椎类模式动物明星斑马鱼(zebrafish,Danio rario)。

一、斑马鱼基本特点:

    原产地:热带淡水鱼,原产于喜马拉雅山南麓的印度、巴基斯坦、孟加拉和尼泊尔等南亚国家。成鱼体长3-100px,略呈纺锤形,头小而稍尖,吻较短,身躯玲珑而纤细,因其体侧具有像斑马一样纵向的暗蓝色与银色相间的条纹而得名。

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    斑马鱼是体外受精发育,胚体透明。胚胎发育快,受精后3天左右孵化出膜,天左右开口进食,约3个月达到性成熟,寿命可达2年以上。斑马鱼可常年产卵,繁殖周期3-4天,一对成年斑马鱼每次可产卵200-300枚,受精率通常在70%以上。养殖温度一般在23-31℃,15℃左右仍可存活,最佳养殖温度在25-28摄氏度之间,pH值在6.8~7.8,硬度在2~6之间。

二、斑马鱼作为模式生物的起源和发展

    1938年,美国布朗大学Roosen-Rung教授首次报道斑马鱼发育形态学研究成果。1950年代,美国罗格斯大学K. Kenneth Hisaoka教授首次报道斑马鱼毒理学研究成果。1972年,美国俄勒冈大学George Streisinge教授开始斑马鱼发育生物学研究和模式动物建立工作。1989年,美国俄勒冈大学Monte Westerfield教授出版斑马鱼研究圣经The Zebrafish Book第一版。1998年,首个斑马鱼模式生物数据库ZFIN成立(http://zfin.org)。1998年,全球第一家斑马鱼药物研发服务外包公司成立。2004年,斑马鱼国际资源中心(ZIRC)在俄勒冈大学成立。2007年,美国环境保护署(EPA)将斑马鱼技术列入其转化毒理学研究项目ToxCast TM。2009年,斑马鱼药物毒理学评价技术首次通过FDA和EMA的GLP认证,这标志着斑马鱼模型的安全药理学和毒理学评价结果可以作为正式材料纳入临床试验申报资料。2010年,中国首家斑马鱼技术服务公司杭州环特生物科技有限公司成立。2011年,斑马鱼模型和技术研究被列入中国科技部“重大新药创制”专项十二五实施计划。2012年,中国国家斑马鱼资源中心成立。2013年,斑马鱼资料首次用于CFDA临床申报。

    经济合作发展组织(OECD)已经颁布了项化学品鱼类(斑马鱼)毒性检测标准,而全球医药巨头辉瑞、罗氏、诺华、葛兰素史克、阿斯利康等都逐渐开始使用斑马鱼技术进行药物筛选研发。

三、斑马鱼作为模式生物的优势

    1、拥有与人相似的组织器官和系统,基因和信号通路与人类高度保守:>85%;生理、发育和代谢与哺乳动物高度相似,美国国立卫生研究院(NIH)将斑马鱼列为继小鼠和大鼠之后的第三大脊椎模式生物。

    2、斑马鱼是目前唯一适于高通量药物筛选的脊椎类动物。

    3、个体小(目前唯一适于进行微孔板高通量药物筛选的脊椎类动物)、发育周期短(24小时器官便可形成)、实验周期短(筛选结果在一周内即可得出)、费用低(约为鼠类的1/10 - 1/100)、体外受精、透明(可直接观察药物对内部器官的作用)、单次产卵数较高(150-200枚)以及实验用药量小(为小鼠用药量的1/100~1/1000>)。

四、 斑马鱼在基础研究领域的应用:发育生物学、基因功能研究、疾病发病机制研究等

    1、斑马鱼可应用于发育生物学的细胞谱系分析、突变鉴别、饱和诱变分析、基因转移研究、基因连锁图的构建,其体外受精、胚体透明、细胞分裂快等特点使它比起大小鼠有独特优势。

    2、基因功能研究:斑马鱼繁殖速度快,能提供足够量的胚胎用于基因筛选;其胚体透明的特点可以一目了然地观察到基因突变后的表型变化。

    3、疾病发病机制研究:斑马鱼的器官发生、疾病生理、基因组与人类相似度较大,主要信号通路和基因具高度同源性,诸多斑马鱼疾病(如血癌、免疫性系统疾病、感染疾病等)模型已建立,利用斑马鱼的疾病模型来研究治愈人类相关疾病是近年全球热点的科研项目。

五、斑马鱼在药物研发中的应用

    斑马鱼模型既具有体外实验快速、高效、费用低等优势,又具有哺乳类动物实验预测性强、可比度高等优点,可以有效弥补体外实验和哺乳类动物实验之间的巨大生物学断层,完善现有药物研发体系。将斑马鱼模型鱼体外实验和哺乳动物实验相结合,可以从整体上缩短药物临床前早期研发的实验周期,降低实验成本,提高实验预测的准确性,进而提高药物研发效率,降低药物研发风险。

    小动物筛选和药物开发过程。利用斑马鱼等小动物模型进行的基于表现型的化合物筛选技术(②)提供了一种不同于传统药物筛选技术(①)的替代方法。也有助于揭示新的疾病分子机理和药物作用靶点(③)(Giacomotto, J., et al., 2010).

    斑马鱼模型融入临床前安全性评价体系.斑马鱼能够在体外实验和哺乳动物实验之间起到很好的桥梁作用,早期发现安全性不佳的候选化合物,降低后期研发失败风险和成本(Sukardi,et.al., 2011).

    沙利度胺(thalidomide)因其致畸性而曾经臭名昭著,美国FDA因阻止沙利度胺进入美国市场而声望大涨。梅里尔公司申请销售前坚称已研究沙利度胺对大鼠和孕妇毫无副作用。应用斑马鱼评价沙利度胺毒性时,可明显看到沙利度胺的发育致畸性——胸鳍发育不全,如下图所示:

    美国食品药品监督管理局(FDA)越来越多地应用斑马鱼对临床前药物进行安全性与毒理性评价,并在其官网介绍其研究成果:

六、斑马鱼在环境检测与化学品风险评估中的应用

ISO-15088-2008

    Determination of the acute toxicity of waste water to zebrafish eggs

OECD 化学品鱼类(斑马鱼)毒性测试标准:

      OECD 203(1992)Fish acute toxicity test

      OECD 204(1984)Fish prolonged toxicity test: 14-day study

      OECD 210(1992)Fish early life-stage toxicity test

      OECD 212(1998)Fish short-term toxicity test on embryo and sac-fry stages

      OECD 215(2000)Fish juvenile growth test

      OECD 229(2009)Fish short-term reproducti-on assay

      OECD 230(2009)21-Day fish screening assay:A Short-Term Screening for 

      Oestrogenic and Androgenic Activity, and Aromatase Inhibition

      OECD 305(1996)Bioconcentra-tion: Flowthrough fish test

      OECD 236 (2013)(FET) Test

中国化学品、环境鱼类(斑马鱼)毒性测试标准:

      GB/T 21806-2008      鱼类幼体生长试验

      GB/T 21807-2008      鱼类胚胎和卵黄囊仔鱼阶段的短期毒性试验

      GB/T 21808-2008      鱼类延长毒性14天试验

      GB/T 21854-2008      鱼类早期生活阶段毒性试验

      GB/T 21858-2008      生物富集 半静态式鱼类试验

      GB/T 21800-2008      生物富集 流水式鱼类试验

      GB/T 27861-2011      化学品 鱼类急性毒性试验

      GB/T 21281-2007      危险化学品鱼类急性毒性分级试验方法

      GB/T 21814-2008      工业废水的试验方法 鱼类急性毒性试验

      GB/T 13267-1991      水质 物质对淡水鱼(斑马鱼)急性毒性测定方法

    转基因斑马鱼广泛应用于水质监测,其对污染物的作用反应快,可在短时间内调查水污染状况或用于特定污染物的检测。将目标质粒注射到斑马鱼体内,斑马鱼经过筛选得到稳定的转基因品系,通过观察荧光蛋白可以用来快速检测不同的环境污染物:

    银纳米粒子因其抗菌作用而广泛应用于洗涤剂和废物处理领域,为了研究银纳米粒子对环境和健康的影响,来自新加坡国立大学化学系的研究者用斑马鱼作用模式生物评价了银纳米粒子对斑马鱼的毒性,结果显示银纳米粒子可造成斑马鱼胚胎死亡、体轴异常、脊索扭曲、血流减慢、心包水肿、心律不齐等:

    与常规物理和化学检测手段相比,应用斑马鱼进行环境监测和化学品研究能实现快速、高效、灵敏、成本低等优点。

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