利用细胞实验评价供试品是否具有光毒性

【评价原理】

光毒性是指皮肤第1次接触光敏性物质后，在无害的日光照射强度下诱发的异常皮肤反应，通常发生在暴露于光照下的皮肤区域，表现为急性发病，类似于晒斑，严重会产生皮肤刺激、红斑、瘙痒、水肿。中性红是一种弱的阳离子染料，极易以非离子扩散的方式穿透细胞膜，并在细胞溶酶体内聚集。某些化学物质和外界条件作用可引起细胞表面或溶酶体膜敏感性的改变，导致溶酶体脆性增高等不可逆的细胞毒性变化，从而导致细胞吸收中性红的能力下降。供试品和紫外线照射联合作用3T3成纤维细胞后，测定细胞吸收中性红的能力来判断供试品是否具有光毒性。

【实验方法】

接种96孔平板：104个细胞/孔，培养24h（37℃、5%-7.5% CO2）。去除培养液，用150μL EBSS/PBS轻柔冲洗细胞一次或两次。分别用100μL 8种不同浓度的受试物处理细胞，培养细胞1h（37℃、5%-7.5% CO2）。室温下暴露于有光照（+Irr）（1.7 mW/cm2）50分钟（即5J/cm2）另一个平板置于黑暗环境50分钟。用150μL EBSS或PBS仔细冲洗细胞两次，再用培养液培养细胞（37℃、5%-7.5% CO2、18h-22h过夜）。显微镜下观察细胞形态学改变；去除培养液，用150μL EBSS或PBS冲洗细胞一次或两次，加入100μL含50 μg/mL中性红的培养液培（37℃、5%-7.5%CO2、3h）。去除中性红培养液，用150μL EBSS或PBS冲洗细胞一次或两次，加入150μL中性红解吸附溶液。震荡平板10分钟。检测在540nm波长下细胞对中性红的吸收情况（反映细胞活性）。

1、通过分析在有光照（+Irr）和无光照（-Irr）两种情况下获得的细胞毒性浓度反应曲线，确定能抑制50%细胞活性的受试物浓度（IC50），按下列公式计算光刺激因子（PIF）。

PIF＝IC50（-Irr）/ IC50（+Irr）

评判标准：PIF≤2：预测“无光毒性”；PIF≥5：预测“有光毒性”。PIF介于2-5之间，需进行重复试验；如果PIF仍介于2-5之间，预测“有潜在光毒性”。

如果受试物在有光照（+Irr）时有细胞毒性，无光照（-Irr）时无细胞毒性，且细胞毒性试验所使用的浓度已达最高受试浓度（Cmax）时，可按照下列公式计算＞PIF：

＞PIF＝Cmax（-Irr）/ IC50（+Irr）

评判标准为：如果只获得一个“＞PIF”，那么任何＞PIF ＞1的值都能提示“有潜在光毒性”。

2、通过在浓度网格上比较有光照（+Irr）和无光照（-Irr）两种情况下获得的细胞毒性浓度反应曲线（i＝1，….，N）可得到平均光效应（MPE），细胞毒性浓度反应曲线的染毒浓度需在有光照（+Irr）和无光照（-Irr）试验共有的浓度范围内选择。浓度Ci的光效应（PEi）等于浓度效应（CEi）和反应效应（REi）的乘积。使用专门的软件“PHOTO32或更高版本”求得平均光效应（MPE），建立以平均光效应（MPE）为基础的预测模型。通过将MPE与临界阈值MPEc比较，预测化学物潜在光毒性的预测模型。

阈值MPEc＝0.1

评判标准：

如果MPE≤0.1：预测无潜在光毒性；

如果MPE≥0.15：预测有潜在光毒性。

如果MPE介于0.1—0.15之间，需进行重复实验；如果MPE仍介于0.1—0.15之间，预测有潜在光毒性。

【评价指标】

光刺激因子（PIF）、平均光效应（MPE）

【结果展示】（仅供参考，实际实验组别依据合同而定）

表1、光毒性实验结果

【评价结论】

1、几种供试品经测试后，光刺激因子PIF＜2，平均光效应MPE≤0.1, 说明这几种供试品无光毒性。

【参考文献】

[1] KIM K, PARK H, LIM K M. Phototoxicity: its mechanism and animal alternative test methods[J]. Toxicol Res, 2015, 31(2): 97-104.

[2] Organization for Economic Cooperation and Development (OECD), 2004[S]. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals Test No. 432. In vitro 3T3 NRU Phototoxicity Test.

[3] 段名扬, 康桦, 桑晶, 等. 应用优化的3T3 细胞中性红摄取试验评价6 种化妆品的光毒性[J]. 中国现代应用药学, 2021, 38(11): 1309-1313.