利用斑马鱼评价供试品舒缓功效

【实验原理】

暴露于生活环境中的皮肤，接触到有毒有害物质后可能引起一定程度的皮肤炎症，出现皮肤红肿、瘙痒等现象。一些医美类化妆品除具有常规护肤功效外还能起到舒缓作用。通过斑马鱼技术能有效评价供试品舒缓功效。

1、化妆品对皮肤的刺激表型主要表现为皮肤炎症，炎症早期主要表现为毛细血管扩张、通透性亢进和水肿。十二烷基磺酸钠（SLS）是人体皮肤刺激物模型斑贴试验常见的阳性对照物，SLS刺激后能诱发表皮炎症细胞浸润，刺激物进入斑马鱼体内，诱导炎症反应，中性粒细胞发生免疫应答，向皮肤表皮迁移并聚集。

2、TNF-α在机体受到刺激时会大量产生,主要来自于活化的巨噬细胞、自然杀伤细胞和T淋巴细胞；IL-6 能够促进中性粒细胞功能上调，促进和调节细胞因子、黏附分子以及一氧化氮等炎症介质分泌；IL-8 由单核细胞和血管内皮细胞分泌生成，炎症发生时其水平迅速升高。IL-1 在炎症反应中传递信息、激活以及调节免疫细胞、增殖与分化炎症其关键作用。若供试品具有能够降低TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8 等炎症因子水平的作用，则说明其具有舒缓的功效。

3、肥大细胞是类过敏反应的主要效应细胞，激活的肥大细胞数量与过敏程度相关，激活的肥大细胞越多，过敏程度越严重。类胰蛋白酶(Tryptase )是肥大细胞内预先合成的中性蛋白酶，是含量最多的介质，在肥大细胞中的储存和表达有高度的选择性。肥大细胞脱颗粒后，类胰蛋白酶会转化成具有活性的构象并被释放到细胞外，Tryptase可作为肥大细胞脱颗粒的标志。

4、斑马鱼受到疼痛时会产生运动轨迹上的变化。通过测定斑马鱼运动轨迹作为伤害性感受阈的测量指标。

【实验方法】

将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和供试品组。正常对照组不做处理，模型对照组仅用SLS处理，供试品组在用SLS的同时添加受试化妆品。孵育一段时间后：

1、将斑马鱼整体放到荧光显微镜下拍照，统计皮肤表面中性粒细胞数量

2、利用Q-PCR检测IL-6等基因相对表达量

3、利用酶标仪检测各组吸光度值（OD值），以OD值分析类胰蛋白酶含量、过敏程度

4、利用斑马鱼行为分析仪检测斑马鱼的运动距离，定量评价供试品的神经舒缓的效果

【评价指标】

1、皮肤中性粒细胞数量

2、炎症因子IL-1α、IL-6、IL-8、TNFα分泌量

3、过敏反应标志物（类胰蛋白酶）含量

4、神经舒缓-总运动距离

【结果展示】

（*展示图片仅供参考，实际实验组别依据合同而定）

1、皮肤中性粒细胞数量

图1.皮肤中性粒细胞表型图 

黄色虚线区域为计算区域，绿色荧光点为中性粒细胞

2、炎症因子表达水平：提供柱状图

图2.斑马鱼IL-6基因相对表达量

3、类胰蛋白酶含量：提供柱状图

图3.类胰蛋白含量柱形图 

4、神经舒缓（镇痛）-总运动距离（轨迹图、柱状图，略）

图4.斑马鱼运动轨迹图 

【评价结论】

供试品斑马鱼中性粒细胞数量、炎症因子表达量、类胰蛋白酶的量与模型对照组相比，明显减少；斑马鱼运动距离与模型对照组相比，明显减少；本实验证明该供试品具有舒缓功效。

【参考文献】

[1]王涛. 丹参酮I的抗炎作用及安全性评价[D]. 广东药科大学, 2018.

[2] Miskolci V, Squirrell J, Rindy J, et al. Distinctin flammatory and wound healing response stocomplex caudal fin injurie soflarval zebrafish[J]. Elife. 2019, 8.

[3] Lavens S E, Proud D, Warner J A. A sensitive colorimetric assay for the release of tryptase from human lung mast cells in vitro[J]. journal of immunological methods, 1993, 166(1):93-102.

[4] Solley G O, Gleich G J, Jordon R E. et al. The late phase of the immediate wheal and flare skin reaction. Its dependence upon IgE antibodies. [J]. Journal of Clinical Investigation, 1976, 58(2):408-420.

[5] 李春启,劳乔聪和俞航萍. 一种斑马鱼类过敏检测模型的建立及其应用: CN201310262123.8 [P]. 2013-06-27.

[6] DUBNER R. Methods of assessing pain in animals. in: Wall P.D. and Melzack R. (eds.): textbook of pain[M].1994: 293-302

[7] 周海鸥, 余跃, 施燕, 徐其远, 张琳琳. 不同剂量乌司他丁对急性胰腺炎患者血清TNF-α，IL-1，IL-6及IL-8 水平的影响[J]. 现代生物医学进展. 2017, 17(21): 4096-4099

[8] 李晓, 董立园, 李晓玉, 王瑞敏, 李国华. 宫内感染致肺损伤仔鼠血清IL-21与TNF-α及MMP-9表达水平[J]. 中华医院感染学杂志. 2021. 31(16): 2497-2501